在饲料资源日益紧张的当下，植物源非粮饲料资源的开发成为解决饲料短缺问题的关键。然而，这类饲料中普遍存在的抗营养因子缩合单宁，限制了其在饲料中的应用。菜籽粕作为常见的植物源饲料，其高效利用对饲料产业意义重大。对缩合单宁降解技术的研究，以及优化菜籽粕固态发酵工艺，成为提升菜籽粕营养价值、推动饲料产业发展的重要方向。

  一、菜籽粕原料特性与试验材料准备

  试验所用菜籽粕来自唐山市某饲料公司，干物质含量为 93.40% 。在干物质基础下，其粗蛋白质含量达 41.17%，粗纤维含量为 25.41%，粗脂肪含量为 1.50%，多肽含量为 3.48%，可溶缩合单宁含量为 0.11%，不溶缩合单宁含量为 0.26%，总缩合单宁含量为 0.37%。此外，试验还使用了从菜籽皮中粗提获得的菜籽皮缩合单宁(RSCT)，其中缩合单宁含量为 45%，聚合度约为 3.68。

  《2025-2030年中国菜籽粕市场专题研究及市场前景预测评估报告》指出，为筛选缩合单宁降解菌，试验准备了多种培养基。驯化培养基以硝酸钠、磷酸氢二等为基础成分，加入浓度从 1g/L 逐渐提高到 5g/L 的缩合单宁滤灭液;初筛培养基加入适量缩合单宁滤灭液;复筛培养基加入适量 RSCT 滤灭液;耐受培养基则在基础成分中加入适量 RSCT 滤灭液，并以葡萄糖作为碳源之一。

  二、菜籽粕缩合单宁降解菌的筛选过程

  (一)菌株驯化

  选取装有永久瘤胃瘘管的荷斯坦奶牛瘤胃液、云南普洱茶和江西某茶园地表土样品，使用稀释混匀法制备菌株富集液。将富集液用无菌生理盐水逐级稀释后，接种于驯化培养基中，在 30℃条件下振荡培养 7d 。之后，取上清液加入缩合单宁浓度递增的驯化培养基，直至浓度达到 5g/L。驯化结束后，将培养液分别涂布于 LB 平板、MRS 平板、YPD 平板和 PDA 平板，选取不同特征的单菌落进行分离纯化，纯化后的菌株于 50% 甘油里 -20℃保存。

  (二)初筛和复筛

  将分离纯化后的菌株活化，接种于初筛培养基，恒温培养 48h 后，离心取上清液测定缩合单宁浓度，选取缩合单宁降解率最高的 10 株菌株进行复筛。复筛时，将菌株接种于复筛培养基，同样培养 48h 后，离心取上清液测定 RSCT 浓度，最终确定 RSCT 降解率最高的菌株 LWY -37 -2 作为目标菌株，其 RSCT 降解率为 62.56%。

  (三)生长曲线测定和底物耐受性评估

  将目标菌株 LWY -37 -2 活化成种子液，按 1% 接种量接种于 LB 培养基，在 37℃振荡培养，每 2h 测定一次 600nm 处的吸光度(OD)值，绘制生长曲线。结果显示，该菌株在 0 - 2h 处于迟滞期，2 - 10h 为对数生长期，16 - 24h 出现第二次生长，22h 达到最大生长浓度。同时，将种子液处理后制成特定浓度的菌悬液，按 2% 接种量分别接种于不同缩合单宁浓度(0.1、0.5、1.0、3.0 和 5.0g/L)的底物耐受培养基中培养，测定 OD 值绘制曲线。结果表明，随着缩合单宁浓度升高，菌株生长趋势下降，但在浓度为 5g/L 时仍能缓慢生长。

  (四)菌株鉴定

  对菌株 LWY -37 -2 进行革兰氏染色，显微镜下观察发现其菌落为浅白色，直径 3 - 4mm，边缘粗糙不规则，中间略微突起且有皱褶;菌株呈紫色短杆状，菌体周围有芽孢产生。通过 16S rDNA 通用引物扩增其 16S rDNA，经序列分析和比对，该菌株与地衣芽孢杆菌具有很高的同源性，相似度达 100%，结合形态学观察，判定其为地衣芽孢杆菌。

  三、菜籽粕固态发酵工艺优化试验

  (一)预试验

  取 250g 菜籽粕，用目标菌株在 1% 接种量(4.2×10⁶CFU/g)、料水比 1:1、温度 37℃条件下发酵 2d，每隔 12h 翻料一次，重复 3 次。发酵后，菜籽粕质地松软，产生白色菌体，带有微酸败味。经测定，可溶缩合单宁降解率为 41.69%，不溶缩合单宁降解率为 2.90% ，由于不溶缩合单宁降解效果不佳，后续选择可溶缩合单宁降解率作为发酵指标。

  (二)基质确定

  将目标菌株接种液分别接种到灭菌与不灭菌的发酵培养基中，条件同预试验。结果显示，灭菌对照菜籽粕有苦味，不灭菌对照菜籽粕有酸香味和霉味;灭菌发酵菜籽粕有酸败味，pH 为 5.30，不灭菌发酵菜籽粕有酸味和氨味，pH 为 4.81。且不灭菌发酵菜籽粕的缩合单宁降解率和多肽增加率均高于灭菌发酵菜籽粕，因此选择生料发酵。

  (三)单因素试验

  采用控制变量法，分别探究温度、pH、接种活菌数、料水比和发酵时间对固态发酵菜籽粕的影响。结果表明，发酵温度为 30℃和 33℃时，缩合单宁降解率显著较高，分别为 42.03% 和 42.44%，考虑节能选择 30℃;初始 pH 为 7 时，降解率最高，达 29.98%;接种活菌数为 5×10⁶CFU/g 时，既能保证较高降解率(41.43%)又可节约成本;料水比为 1.0:1.0 时，降解率显著高于其他比例，为 34.98%;发酵时间为 3d 时，降解率最高，为 26.99%。

  (四)正交试验

  以发酵时间、温度和料水比为因素，设计 3 因素 ×3 水平的 L₉(3⁴) 正交试验。以缩合单宁降解率和多肽增加率为评价指标，通过加权法计算总变化率进行综合评价。结果表明，最佳固态发酵工艺为发酵温度 30℃，料水比 1.0:0.8，发酵时间 3d，各因素对总变化率的影响排序为发酵时间 > 料水比 > 发酵温度。

  (五)最优工艺验证

  在最优工艺条件下(接种活菌数 5×10⁶CFU/g，生料发酵，初始 pH 为 7)发酵 500g 菜籽粕。发酵后，菜籽粕质地松散，颜色呈黄褐色，气味酸香，pH 为 5.10。可溶缩合单宁降解率为 64.98%，不溶缩合单宁降解率为 4.47%，总缩合单宁降解率为 22.96%，多肽增加率为 151.63%，总变化率为 77.97%，效果显著优于正交试验最高组。同时，发酵后菜籽粕粗蛋白质含量提高至 42.86%，粗脂肪含量降低至 0.40%，中性洗涤纤维和酸性洗涤纤维含量也有所降低，总氨基酸含量提高了 3.21%。

  四、菜籽粕发酵相关讨论

  缩合单宁广泛存在于植物中，是菜籽粕的主要抗营养因子之一。利用微生物发酵技术降解缩合单宁是一种有效方法。本试验中，目标菌株来源于瘤胃，与以往研究中食草动物来源微生物具有降解缩合单宁潜力的结论相符。

  地衣芽孢杆菌在降解植物抗营养因子方面有一定能力。本试验得到的地衣芽孢杆菌 LWY -37 -2 在缩合单宁浓度较高时仍能生长，显示出其在降解缩合单宁方面的潜力。尽管以往对其降解缩合单宁的报道较少，但经驯化后可能产生相关变化使其具备该能力。

  发酵条件对菜籽粕发酵效果影响显著。生料发酵效果更好，可能是因为菜籽粕中内生微生物与地衣芽孢杆菌协同作用。发酵温度、时间、料水比、pH 和接种活菌数等因素，通过影响菌种生长和代谢，进而影响发酵效果。例如，温度过高会使酶失活，料水比影响基质含氧量等。

  微生物发酵显著改善了菜籽粕品质。发酵后粗蛋白质含量增加，主要是由于 “浓缩效应”;粗脂肪含量降低是因为地衣芽孢杆菌利用脂肪作为碳源;纤维变化与地衣芽孢杆菌产纤维素酶有关。同时，发酵提高了菜籽粕的总氨基酸含量，改善了氨基酸平衡。

  五、研究总结

  通过一系列试验，成功筛选出一株能高效降解缩合单宁的天然菌株地衣芽孢杆菌LWY -37 -2，其对缩合单宁和 RSCT 的降解率分别达到76.40%和62.56% 。确定了单菌固态发酵菜籽粕的最优工艺，即生料发酵，接种活菌数 5×10⁶CFU/g，初始 pH 为 7，温度 30℃，料水比 1.0:0.8，发酵时间 3d。在该最优工艺下，固态发酵菜籽粕的可溶缩合单宁降解率为 64.98%，不溶缩合单宁降解率为 4.47%，总缩合单宁降解率为22.96%，多肽增加率为151.63%，总变化率为77.97%，有效提高了菜籽粕的粗蛋白质含量，降低了纤维和粗脂肪含量，提升了总氨基酸含量，显著改善了菜籽粕的营养价值。这一研究成果为菜籽粕等非粮饲料资源的高效利用提供了新途径，对推动2025年菜籽粕产业发展具有重要意义。