在生物制药领域，白蛋白作为一种关键的血液制品，其质量控制和精准分析技术一直备受关注。随着生物技术的不断演进，对于白蛋白的鉴定与定量方法也在持续革新。尤其是在2025年，行业内对白蛋白分析技术的准确性、高效性提出了更高要求，旨在确保白蛋白制品的安全性和有效性，满足临床救治危急、重症患者的广泛需求。

  一、人血白蛋白的重要性与现行分析方法局限

  人血白蛋白来源于健康人血浆，在临床上应用极为广泛，可用于失血性创伤、烧伤休克、脑水肿、颅内压升高、肝硬化及肾病腹水、低蛋白血症防治、新生儿高胆红素血症、心肺复苏术、烧伤辅助治疗、血液透析辅助治疗以及呼吸窘迫综合征治疗等诸多方面。

  《2025-2030年全球及中国白蛋白行业市场现状调研及发展前景分析报告》指出，目前国内上市的人血白蛋白主要遵循《中国药典》2020 年版(三部)标准。在鉴别方面，采用 “免疫双扩散法” 和 “免疫电泳法”，然而这两种方法对实验人员技术要求高，检验周期长。在 “蛋白质含量” 测定上，使用 “凯氏定氮法”，存在步骤繁杂、操作复杂、结果易受操作环节和人为因素影响、分析效率低等问题。因此，开发一种安全、有效、快速、便捷的分析方法迫在眉睫。

  二、基于特征肽液质联用技术的新方案

  (一)仪器与试药准备

  实验选用了一系列先进仪器，如高效液相色谱 - 高分辨质谱联用仪、高分辨质谱仪、纳升液相系统、超纯水仪、电子天平、冰箱、离心机、数显恒温水浴锅等。试药包括不同厂家及批次的人血白蛋白、特征肽标准品、多种动物血清(猪、羊、马、胎牛血清等)、甲酸、乙腈、胰蛋白酶等。

  (二)液相色谱质谱条件设定

  特征肽段筛选条件

  色谱条件：以特定纳升色谱柱为固定相，乙腈的甲酸水溶液和 98% 乙腈的 0.1% 甲酸水溶液为流动相进行梯度洗脱，进样室温度 7℃，进样体积 2μL，分离泵流速 300 nL・min⁻¹。

  质谱条件：采用正离子模式，喷雾电压 2.0kV，离子传输毛细管温度 275℃，S - Lens 传输效率 60%，一级和二级质谱均用 Orbitrap 作为质量分析器，分辨率 60000，采集范围 350 - 1500(m/z)，二级质谱采用 Rapidspeed 模式扫描，利用 Top20 数据依赖模式选择母离子，HCD 模式碎裂，碎裂能量 NCE 设为 28%。

  定性鉴别及定量分析条件

  液相色谱条件：以 Waters ACQUITY UPLC BEH C₁₈色谱柱为固定相，含 0.1% 甲酸水溶液和含 0.1% 甲酸乙腈溶液为流动相进行梯度洗脱，流速 0.2 mL・min⁻¹，柱温 40℃，进样量 2μL，进样器温度 8℃。

  质谱条件：电喷雾离子源(ESI)，正离子平行反应监测(PRM)模式，涡旋离子喷雾温度 450℃，离子化电压 4.5kV，碰撞室出口电压 7V，入口电压(EP)7V，特征肽定性离子对两对(m/z507.5→189.2 和 507.5→132.1)，碰撞能量分别为 20V、35V，去簇电压均为 80V，选择 m/z507.5→189.2 为定量离子对。

  (三)溶液制备流程

  特征肽筛选样品溶液：将待测样品用碳酸氢铵溶液稀释，加入胰蛋白酶，在具塞离心管中涡旋混匀，37℃水浴酶解过夜后，90℃高温灭活 15min，经离心后取上清液稀释备用。

  定性与定量分析方法学供试品溶液：对样品进行一系列稀释操作后，加入胰蛋白酶，酶解 16h，后续处理步骤与特征肽筛选样品溶液类似。

  定性与定量分析方法学专属性溶液：对多种动物血浆进行稀释，按照特定方法处理后取上清液。

  定性与定量分析方法学线性标准曲线溶液：精密称取特征肽标准品，经溶解、稀释等操作制备成不同浓度的线性标准曲线溶液。

  (四)特征肽筛选结果

  通过将样品溶液注入纳升液相高分辨质谱联用仪，比对质谱数据库并结合肽段筛选原则，最终确定氨基酸序列为 LVAASQAALGL 的特征肽作为人血白蛋白的检测特征肽。该肽段与其他动物蛋白序列比对具有特异性，其二级质谱图也呈现出独特特征。

  (五)酶解时间及酶用量优化

  酶用量优化：通过实验发现，胰蛋白酶加入量在 20 - 80μL 范围内离子对响应强度稳定，且在 20μL 时开始趋于稳定，综合考虑选择 40μL 进行后续实验。

  酶解时间优化：酶解时间在 6 - 24h 范围内较为稳定，且在 6h 时开始趋于稳定，最终选择 16h 作为胰蛋白酶的酶解时间用于后续实验。

  三、新方法的验证与实际应用

  (一)方法学验证

  专属性试验：分析结果显示，人血白蛋白特征肽保留时间为 5.1min，而猪、马、牛、绵羊和山羊血清样品在相同保留时间处未检出特定离子对，表明该方法专属性良好。

  线性与范围：特征肽在 12.5 - 100 ng・mL⁻¹ 浓度范围内呈线性关系，线性回归方程为 Y = 11598X + 20118，相关系数 r = 0.9964。

  检出限与定量限：人血白蛋白特征肽的检出限浓度为 3.75 ng・mL⁻¹，定量限浓度为 2.5 ng・mL⁻¹。

  系统精密度试验：连续进样 6 针，特征肽定量离子对的离子峰面积 RSD 为 2.4%，表明方法系统精密度良好。

  重复性试验：同批人血白蛋白样品制备 6 份进行分析，特征肽平均浓度为 36.35 ng・mL⁻¹，RSD 良好，说明该方法重复性佳。

  回收率试验：特征肽回收率范围在 92.31% - 99.72%，平均回收率为 94.95%，RSD 为 2.9%。

  稳定性试验：36h 内，样品溶液中特征肽定量离子对峰面积 RSD 为 3.9%，表明样品溶液稳定性良好。

  (二)样品测定结果

  对两个厂家6个批次的人血白蛋白样品进行测定，以标准曲线法计算特征肽含量，并与人血白蛋白理论蛋白质含量比较。通过特征肽法和凯氏定氮法测得人血白蛋白含量比值为 0.90 - 1.05，两种测定方法结果基本一致。

  四、总结

  在2025年白蛋白行业技术发展进程中，基于特征肽液质联用技术为白蛋白的鉴定与定量分析带来了新的突破。该技术通过胰蛋白酶酶解人血白蛋白，筛选出稳定的靶向特征肽 LVAASQAALGL，利用 HPLC - MS/MS 技术实现了对人血白蛋白种属来源的精准确定以及含量的准确测定。新方法克服了传统分析方法的诸多弊端，具有安全、准确、快速、简便的优势，为白蛋白质量控制提供了更为可靠的技术手段，有望在未来白蛋白生产和临床应用中发挥重要作用，推动白蛋白行业技术水平迈向新的高度。